解決方案：
以上的分析可能對(duì)于初學(xué)者還是不容易的，下面我就把我的排除實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程與大家進(jìn)行分享、交流和討論。
1、首先排除抗體孵育條件。一般來(lái)說(shuō)，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來(lái)過(guò)一次且效果不錯(cuò)，因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先排除。
2、其次，DAB孵育時(shí)間是否太長(zhǎng)？做出來(lái)那一次我是孵育8min，后來(lái)也是8-10min，我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來(lái)排除該因素。結(jié)果孵育2.5min時(shí)先出現(xiàn)背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現(xiàn)特異性染色，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。
3、zui后，血清封閉的問(wèn)題？以前我一般孵育15-30min，所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來(lái)的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。
4、此外，我在改進(jìn)的同時(shí)，也對(duì)PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)，甚至*參照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行操作，以及過(guò)氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。
我冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，與*次做出來(lái)相比，只有兩個(gè)地方做了改動(dòng)：因血清不夠而更換了不同試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買(mǎi)了抗體稀釋液。
5、我用PBS替代一抗稀釋液（我以前還回收抗體，自我覺(jué)得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑），其它步驟和組織切片*與*次做出來(lái)的一致（包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)），奇跡出現(xiàn)了：結(jié)果很好?！?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是PH值，于是我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，結(jié)果是前者偏酸性（<6.0），而后兩者均在7.5左右。
6、看來(lái)主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問(wèn)題了，于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化，結(jié)果還是沒(méi)有做出來(lái)：背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎？通過(guò)仔細(xì)分析：一抗一定是結(jié)合上去了（老SP試劑盒結(jié)果很好），問(wèn)題是二抗沒(méi)有結(jié)合上去也不對(duì)（因?yàn)閦ui后背景很深，這說(shuō)明二抗可能也結(jié)合上去了），DAB孵育時(shí)間現(xiàn)在只用1.5min也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。
7、我做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清，其余試劑（二抗、SP）均用新試劑盒提供的，結(jié)果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。——看來(lái)封閉血清也是罪會(huì)禍?zhǔn)字弧?/p>
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