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DAB染色后切片著色一片黃的解決方案
更新時(shí)間:2015-11-11   點(diǎn)擊次數(shù):2538次

解決方案:

    以上的分析可能對(duì)于初學(xué)者還是不容易的,下面我就把我的排除實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程與大家進(jìn)行分享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來(lái)說(shuō),著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的,由于用SP法已經(jīng)做出來(lái)過(guò)一次且效果不錯(cuò),因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析,這種因素可以先排除。

2、其次,DAB孵育時(shí)間是否太長(zhǎng)?做出來(lái)那一次我是孵育8min,后來(lái)也是8-10min,我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來(lái)排除該因素。結(jié)果孵育2.5min時(shí)先出現(xiàn)背景,而特異性染色較淺,故這不符合常理,一般先出現(xiàn)特異性染色,然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。

3、zui后,血清封閉的問(wèn)題?以前我一般孵育15-30min,所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h,其它條件同做出來(lái)的那一次,結(jié)果也一樣背景著色很深。

4、此外,我在改進(jìn)的同時(shí),也對(duì)PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù),甚至*參照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行操作,以及過(guò)氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程,與*次做出來(lái)相比,只有兩個(gè)地方做了改動(dòng):因血清不夠而更換了不同試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買(mǎi)了抗體稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體,自我覺(jué)得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑),其它步驟和組織切片*與*次做出來(lái)的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)),奇跡出現(xiàn)了:結(jié)果很好?!?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外,然后就是PH值,于是我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值,結(jié)果是前者偏酸性(<6.0),而后兩者均在7.5左右。

6、看來(lái)主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問(wèn)題了,于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化,結(jié)果還是沒(méi)有做出來(lái):背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過(guò)仔細(xì)分析:一抗一定是結(jié)合上去了(老SP試劑盒結(jié)果很好),問(wèn)題是二抗沒(méi)有結(jié)合上去也不對(duì)(因?yàn)閦ui后背景很深,這說(shuō)明二抗可能也結(jié)合上去了),DAB孵育時(shí)間現(xiàn)在只用1.5min也是背景深而特異性染色淺,那我又懷疑封閉血清了。

7、我做了兩張切片:一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清,其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的,結(jié)果是前一張效果很好,而后一張能夠看到特異性染色,但背景太深,拍照效果不佳?!磥?lái)封閉血清也是罪會(huì)禍?zhǔn)字弧?/p>

 

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